脂质体制备中的TFF（四）：siRNA LNP
中空纤维切向流过滤技术可高效用于siRNA 脂质纳米颗粒（LNP）的换液和浓缩。
RNAi技术因几乎可沉默任何基因，是一种极具吸引力的治疗形式。但RNAi的有效递送过程成为了其临床应用最大的障碍。为达到所需效力，siRNA需经体内运输、结合并被靶细胞摄入，并穿越细胞质膜，进入胞质区间，达到作用位点。为保证其“有用性”，制剂和给药的简单化、总成本的控制以及任何相关的毒性都是需要考虑的基本要素。
树突状细胞（DC）是免疫反应的中枢调节者，DC具有异源性，亚群根据表型、功能和位置来确定。可敲除不同DC群落内特定基因表达的递送载体，是靶向不同疾病的有力治疗工具，包括肿瘤、感染性疾病、自身免疫，或者作为疫苗组成成分。所以，可将siRNA递送至特定DC亚群的平台对于抑制或激活免疫反应将是非常有用的工具。
脂质纳米颗粒（LNP）是一种将siRNA递送至肝细胞的先进平台技术，已经用于需要肝性基因沉默情况的临床评估。LNP通常含有可电离的阳离子脂质（pKa~6.5），通过低pH条件下的静电反应，结合核酸。LNP细胞摄入后，在酸性核内体中，脂质的离子化会促进siRNA逸出至细胞溶质。但除肝外，siRNA递送至其它细胞具有一定的挑战性，特别是免疫细胞，如DC，在体内和体外，其 对于siRNA摄入都有相对的抗性。
LNP及其衍生物的效力已被评估用于RNAi介导的体内和体外巨噬细胞（MO）和DC的基因沉默。高剂量的LNP（~5mg/kg）可达到LNP摄取和中度的基因沉默。但显然，LNP制剂需进一步优化，以在免疫细胞中达到最佳的基因沉默效果。
基于先前的报导推测，LNP平台可作为将siRNA递送至DC，并修饰免疫反应。为达到这个目的，实验使用DC受体DEC205（在CD8α+DC上高表达的C型凝集素）特异性单链抗体（scFv）对LNP进行修饰。DEC205+DC介导抗原的交叉递呈，导致CD8+T-细胞反应的调整。所以，通过DEC205+DC抑制基因表达是调节CD8+T-细胞激活的潜在有力工具。
siRNA结构示意图（J.katakowski,et al.,2015）
LNP使用摩尔百分比15:40:5:10的DSPC、胆固醇、DSPE-PEG-MAL和DlinDMA合成。脂质偶联荧光素，以监测LNP递送。LNP通过乙醇稀释的自发囊泡形成法制备。脂质体混合液过200和80nm孔径膜连续挤出。挤出的脂质混合液与siRNA快速混合并涡旋，PBS透析。scFv连接时，将LNP和还原的scFv在室温下混合1h，游离的马来酰亚胺基团用β-巯基乙醇淬火。使用MWCO 500kD的MicroKros中空纤维切向流过滤组件换液至PBS，并对LNP进行浓缩。
动态光散射分析LNP粒径和多分散性，冷冻电镜确认LNP尺寸、几何结构和脂质双层。siRNA整合使用Quant-iT RiboGreen RNA分析确认。SDS-PAGE确定偶联效率（未偶联的scFv~30kD，scFv-DSPE-PEG-MAL~33kD）。
之后的小鼠实验结果显示，注射包封siRNA的DEC-LNP可优先递送至DEC205+ DC，摄入含有共刺激分子CD40、CD80和CD86特异性siRNA的DEC-LNP，进行基因敲除，可显著降低基因表达水平。实验证实了基因敲除的功能和混合淋巴细胞反应（MLR）。
总体来说，注射经修饰而限制其被不同细胞群落摄入的LNP，可产生显著的基因敲除，足以抑制较强的免疫反应，如MLR。与非靶向递送相比，这种方法可将siRNA介导的基因沉默的效率增加10倍，所以，这种靶向策略对于调节多重免疫介导的疾病具有有效性。
参考文献：J.A.Katakowski, G.Mukherjee,S.E.Wilner, et al., Delivery of siRNAs to Dendritic Cells Using DEC205-Targeted Lipid Nanoparticles to Inhibit Immune Responses. Official journal of the American Society of Gene & Cell Therapy, 2016,vol.24 no.1,146-155.
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