基于中空纤维TFF的脂质体GMP下游处理：维持产物质量属性，且收率>95%
来自英国斯特拉斯克莱德大学和加拿大Precisions Nanosystems Inc等的研究人员在2020年3月的《International Journal of Pharmaceutics》杂志上发表了题为“Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes”的文章。文中，研究人员指出，纳米药物因其可提高治疗效果而得到了广泛的认可。但是，由于纳米药物较为复杂，使用传统方法生产通常具有一定的挑战性，且成本较高。为了对纳米药物进行更深入的开发，必须采用新的生产技术，以降低开发成本，并提供一致的产物。所以，研究人员测试了纳米药物的微流生产。实验使用载蛋白质的脂质体为例，以严格定义的物化参数（粒径、PDI、蛋白质载入和溶出），制备了从小规模（<1mL）到GMP体积生产（200mL/min）的脂质体。为实现这一目标，实验研究了两种不同的层流微流腔设计（基于交错人字形设计和新型环形混合器设计）；实验首次证实了微流腔设计的使用，其可应用相同的标准化常规操作参数，实现从台式规模（12mL/min）到GMP生产要求（>20L/h）的无缝规模放大。实验同时证明了切向流过滤在下游工艺中的应用及其高产物收率。文章确认了脂质体产物可使用不依赖于规模的生产工艺，快速且可重复地生产，从而避免了从实验室规模到获批产物生产的规模放大风险。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
纳米医学的发展仍在继续促进医疗健康的进步，而基于脂质的制剂扮演着核心角色。自从第一个药物AmBisome®（Gilead）于1990年在欧洲获批以来，已经有多个脂质纳米药物获批（Doxil®/Caelyx®、DaunoXome®、Myocet®、Visudyne®、Marqibo®、Onivyde®以及Vyxeos®）。这些产品中的大多数被用于优化药物递送，降低与所包封细胞毒性药物相关的脱靶毒性。这可通过粒径控制（<100nm）、高药物载入、低双分子层渗透性（通过整合高转变温度的脂质和胆固醇）以及近中性表面电荷和/或PEG修饰来实现。除了传统小分子的递送外，基于脂质的纳米颗粒也可用于递送基于核酸的药物；FDA和EMA于2018年批准的Patisiran（Onpattro®，Alnylam），是第一款获批的基于小干扰RNA的药物。Patisiran用于遗传性经胸腺视蛋白介导的淀粉样变性多神经病的治疗，其输液终产物含有2.0mg/mL Patisiran（以双链小干扰核糖核酸（siRNA）为活性底物），整合至脂质纳米颗粒，使用磷酸盐缓冲液。纳米颗粒粒径为60-100nm，设计用于将药物递送至肝细胞。纳米颗粒通过将siRNA与四种脂质赋形剂混合形成：DSPC、胆固醇、DLin-MC3-DMA以及DMG-PEG2000，其中DSPC和胆固醇也是药物成分，而DLin-MC3-DMA和DMG-PEG2000为新型赋形剂。每1mL Partisirin含有3.3mg DSPC、6.2mg 胆固醇、13.0mg DLin-MC3-DMA以及1.6mg DMG-PEG2000，这些脂质与siRNA结合形成脂质纳米颗粒，保护siRNA不被血液循环降解，提高肝脏中靶向位点的递送。
脂质体和基于脂质的纳米药物的生产
脂质体和基于脂质的纳米药物通常以一系列的粒径降低方法生产（如均质或挤出），这种方法被用于粒径较大的脂质体，其初步形成使用脂质水化过程。例如，AmBisome®和Caelyx®通过起始的脂质水化步骤形成脂质体，然后通过高压均质降低至所需的粒径。对于AmBisome®，活性药物底物（API；两性霉素B）在水性介质中溶解性很差，所以通过将药物包封在脂质体的磷脂膜中制剂。但是，两性霉素B在通常用于脂质体生产的溶剂中的溶解性也比较低，如甲醇。所以，在DSPG酸化后，在两性霉素B和DSPG之间形成药物-脂质混合物，然后混合进剩余的脂质成分（氢化磷脂酰胆碱和胆固醇）。然后脂质混合液吹干，去除溶剂。吹干的粉剂随后在水性介质中水化，形成的大囊泡通过高剪切处理器，如微流设备，降低至小的单层囊泡。在整个过程中，药物保留在脂质双分子层内。相反，Caelyx®/Doxil®生产时，脂质体生成后，通过跨膜pH梯度，将API（阿霉素）载入脂质体。在这种方法中，脂质体在悬液中生产，硫酸铵或柠檬酸盐含在脂质体的水性内核中。当脂质体粒径降低，脂质体悬液进行缓冲液置换，形成跨膜pH梯度（脂质体外高pH，脂质体内低pH）。载入药物时，脂质体与阿霉素混合，pH梯度会驱使阿霉素进入脂质体，提高载药率（>90%）。
可见，在这些产品中，生产过程可以用“从上至下”来描述，即先形成较大的多层囊泡，然后降低粒径。这通常会限制生产，因为生产需要以多个低到中等产量的批次进行，提高了成本。此外，使用这些方法时，药物被动整合进水性内核（没有跨膜梯度辅助时）的效率很低（<10%），降低粒径的步骤还可能导致生物制品的降解，包括蛋白质、多肽和核酸。相反，对于Onpatrro®的生产，生产工艺使用微流设备，以促进低pH（pH4.0）条件下，乙醇中的脂质与水性介质中的siRNA快速混合。混合过程可使乙醇被快速稀释以及纳米颗粒的形成，而不需要降低粒径的步骤，整个生产过程包括5个步骤：1）制备活性底物（使用水性缓冲液）以及脂质溶液（使用乙醇）；2）两种溶液混合，形成脂质纳米颗粒（LNP）；3）超滤，置换缓冲液并初步浓缩；4）稀释至最终浓度，生物负荷过滤以及5）除菌过滤并灌装。
材料和方法
详细的实验操作，包括脂质体微流生产、产品分析（颗粒粒径分布、脂质体浓度定量、蛋白质/阿霉素包封效率、冷冻电镜分析以及数据统计）等，请参考原文。
使用切向流过滤进行纳米颗粒和脂质制剂的下游生产和纯化
使用KrosFlo® Research 2i 切向流过滤（TFF）系统及100、500或750kD中空纤维柱，以12体积洗滤，从脂质体悬液中去除溶剂和未包封的药物。系统以21mL/min运行。GMP生产时，使用100kD mPES过滤器。对于包封了PolyA的脂质体，将样品以1:10稀释，使乙醇浓度降低至5%。实验测试了TFF在纳米颗粒下游处理中的适用性；对TFF前、后产物的理化特性进行了比较，以评估其对不同制剂下游工艺的影响。使用4 mg/mL的起始脂质浓度，制备脂质制剂，包括DSPC:Chol（2:1 w/w）、DSPC:Chol:DOPS（10:5:4 w/w）以及DSPC:Chol:阳离子可溶脂质:DMG-PEG2000（14:32:45:9 w/w）。可电离脂质制剂以1:1 FRR和10mL/min TFR制备。对于HSPC:Chol:DSPE-PEG2000（3:1:1 w/w）脂质体，使用10mg/mL的起始浓度以及12mL/min的1.5:1 FRR，阿霉素随后以0.125 g/g脂质体脂质载入。对于纳米颗粒制剂，载有三硬脂酸甘油酯和mPEG-DSPE（5:1 w/w）的OVA以15 mL/min TFR和FRR3:1以及0.25 mg/mL 起始OVA浓度生产。PLGA 50:50 （10 mg/mL 起始）以1:1 FRR和TFR 10mL/min并以Tris 缓冲液作为水相生产。所有制剂在TFF纯化前、后使用动态光散射（DLS）检测流体力学粒径（Z-平均）以鉴定。纯化后，检测系统残留量和产物回收率。通过将DilC以0.2mol%加入脂质双分子层，并在TFF前、后使用相同的荧光检测，以对照标准曲线进行脂质定量，从而定量计算脂质体回收率。PLGA产物收率使用二喹啉甲酸（BCA）分析试剂盒检测。
蛋白质从脂质体的溶出
包封OVA的DSPC:Chol脂质体（2:1 w/w）生产条件为3:1流速比，1个流速为15mL/min，起始脂质浓度为16mg/mL（溶解于甲醇）以及1mg/mL起始OVA（溶解于PBS）。1mL纯化的制剂置于Spectra/Por® 生物技术级纤维素酯（CE）300kD透析袋内，并置于20mL PBS中。样品在37℃条件下孵育并搅拌，在0、24、48、72以及120h时，取100μL 脂质体样品，使用RP-HPLC方法定量检测脂质体内的蛋白质含量。
结果与讨论
使用切向流过滤进行的纳米颗粒和脂质制剂下游生产及纯化。
对TFF前、后的产品进行理化性质比较，以评估下游工艺对不同制剂的影响。脂质体制剂、固体纳米颗粒以及聚合物纳米颗粒均使用微流生产方式制备。所有制剂在TFF前、后使用DLS检测流体力学粒径（Z-平均）、PDI以及zeta-电位。纯化后，检测系统载药以及产物收率。结果以平均值±SD，表示三个独立批次结果。
纳米药物的下游工艺
作为脂质体和纳米颗粒生产工艺的一部分，纯化步骤必不可少。对于脂质体从实验室到GMP生产，实验使用切向流过滤去除溶剂和未包封的药物。该工艺可用于以微流生产的不同脂质体和纳米颗粒制剂。为测试不同的脂质体制剂，实验制备了中性脂质体（DSPC:Chol）、阴离子脂质体（DSPC:Chol:DOPS）、PEG修饰脂质体（HPSC:Chol:DSPE-PEG2000）以及以可电离脂质制备的脂质体（DSPC:Chol:可电离脂质:DMG-PEG2000）。每种制剂在切向流过滤纯化前、后进行定性检测。结果证实，TFF处理不会改变颗粒粒径、PDI以及Z-电位，且可获得高产物收率（>95%的脂质体产物）。为测试该纯化工艺更广泛的应用，使用微流系统制备了固体脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒，并以切向流过滤纯化。同样，纯化处理后，纳米颗粒属性得以保留，且可获得高产物收率。
总结来说，使用切向流过滤进行的可放大的下游工艺处理可用于支持纳米药物的微流生产。在本研究中，实验使用单根中空纤维柱并通过循环进行漂洗，此外，也可以增加TFF组件的面积或多根并联使用，以降低处理时间，简化操作。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：C.Webb, N.Forbes, C.B.Roces, Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. International Journal of Pharmaceutics, 2020, https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119266.
编者按：
使用中空纤维切向流过滤进行脂质体及纳米颗粒下游处理的优势
· 相比离心等传统分离方式，更容易实现从实验室到GMP生产的线性规模放大
· 可通过优化的系统和软件设计，实现自动化操作，降低人工干预，简化操作
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