用于脂质纳米颗粒（LNP）纯化的切向流过滤技术

自上世纪60年代脂质体发现以来，LNP已处于药物递送系统的主流位置，其使用纳米技术，可良好适用于不同治疗性药物的稳定、高效递送。而近两年，LNP作为COVID-19 mRNA疫苗的重要组成部分更获得了全球性的关注，其在有效保护mRNA并将后者递送至细胞的过程中扮演着重要的角色。

脂质体是第一代的LNP，也是最早的纳米药物递送平台，成功从概念发展到了临床应用。自发现以来，已经取得大量的技术进步，包括从脂质体形成到脂质体靶向的方案，以提高其功能性。目前已有多种脂质体药物获批，包括Doxil（多柔比星），一种用于治疗卵巢癌的抗肿瘤药物，以及Epaxal，一种用作肝炎疫苗的蛋白质抗原。早期脂质体的生产方法较为复杂，需使用有机溶剂，药物包封效率通常较低，且较难在大规模条件下执行。此外，脂质体受限于在血流中较短的循环时间、较差的稳定性以及缺乏选择性靶向等挑战。

为了克服这些挑战，脂质体颗粒的修饰和工程处理推动了更加先进的脂质纳米颗粒的改进。先进LNP开发的关键原则在于结构以及应用方面，前者包括LNP的生物相容性、LNP的流动性、相态和相变温度、电荷（zeta电势）、粒径以及包封效率和稳定性；后者包括毒性、循环时间、细胞摄入以及载荷释放等。目前，LNP在有效性、选择性以及药物的体内分布方便实现了显著的优化，同时降低了传统药物载体系统的毒性和局限性。

脂质纳米颗粒类型（R.Tenchov, et al., 2021）

不同类型的LNP有不同的优势和缺点，这决定了它们在不同治疗药物中的应用。一种新兴的药物类型是核酸治疗药物，其显示具有治疗多种疾病的潜力。第一个获得批准的此类药物是Patisiran（ONPATTRO），一种使用LNP制剂的小干扰RNA（siRNA），用于减少肝内转甲状腺素蛋白的形成，以治疗遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性。

可能LNP最为人所知的最新应用是在Pfizer/BioNTech和Moderna开发的获批COVID-19信使RNA（mRNA）疫苗中作为递送载体。这些疫苗将编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA递送至宿主细胞的细胞质，在此，其被翻译并作为抗原，以诱导形成针对病毒的免疫反应。

mRNA和脂质纳米颗粒开发部分关键里程碑的时间线（X.Hou, et al., 2021）

用于mRNA的LNP配方通常包括多个组成部分，其主要功能成分为可离子化阳离子脂质，通常占整个结构的50%左右，它们在形成过程中促进核酸的捕获，在循环过程中帮助维持中性电荷，并促进细胞内运输。然后是胆固醇，约占结构的40%，由于它的疏水性，有助于提供刚性、配方稳定性并支持控释。之后是PEG脂质成分，约1-2%，这有助于控制和维持颗粒粒径，并通过防止血液中的调理素作用，延长循环时间。最后10%左右的配方由结构脂质成分组成，如DSPC和DOPE，其有助于提供配方的整体结构稳定性，以及在生产和长期存储期间的稳定性。通过优化LNP，可显著提高基于LNP-mRNA的治疗药物的安全性和有效性，包括针对不同应用路径的可电离脂质和可生物降解脂质的创新；LNP-mRNA组成优化，如改变脂质比例或脂质-mRNA比例；创新隐形脂质；以及通过针对特定组织的定位和LNP-mRNA治疗药物对特定细胞类型和器官的主动靶向，改善当前的脱靶效应，并为难以靶向的组织的新应用铺平道路。

LNP-mRNA制剂常采用交错Y型微流控设备进行生产，其中，一股进样液流为处于酸性缓冲液中的mRNA，另一股进样液流为溶解在乙醇中的脂质。两股进样液流在混合通道中相遇、混合，并以单股液流流出设备。微流控设备之后，mRNA链将被包封在LNP中。此时，需要使用切向流过滤（TFF）去除mRNA-LNP之外的所有元素，包括微流控步骤使用的溶剂，并进行缓冲液置换。

切向流过滤是生物药生产中的常见单元操作，用于目标产物的纯化、浓缩以及缓冲液置换，与直流过滤相比，其通过料液平行于膜表面切向循环流动而形成冲扫，降低污染物在膜表面的积聚以及凝胶层的形成，缓解污染，提高单位膜表面积的处理能力，且因连续循环的液流模式，可将滤液或截留液中的产物作为待回收的目标产品。基于膜结构设计，常见的切向流过滤方式可分别平板膜包和中空纤维两种形式。此外，影响切向流过滤步骤性能的因素还包括膜材质、膜孔径/截留分子量（MWCO）、泵驱动形式以及管路设计等配置以及诸如跨膜压（TMP）、剪切力以及过滤通量等过程参数，需根据目标产品的特性进行选择和优化，特别是对于mRNA-LNP这类对工艺过程中的外部应力条件较为敏感的产品。

中空纤维是纤维管状膜，膜壁上有过滤膜孔，不同数量的纤维灌封在管状外壳内，形成过滤组件，每根中空纤维的内腔是开放式的流道，所以中空纤维内的液流处于一种接近温和层流的状态。平板膜包是多层平面膜堆叠在一起，中间以间隔筛网隔开，形成流道，平板膜包内的液流状态更接近湍流，以提高对膜表面的冲洗作用。多数情况下，如目标产品对剪切影响较为敏感，采用基于中空纤维的切向流过滤形式更有利于保护产品的结构完整性，而平板膜包内的湍流促进效果以及其可耐受更高操作压力的特点，在其它条件相似的情况下，可能使其获得更高的通量。对于mRNA-LNP，可优先选择测试中空纤维过滤器形式，以保证完整产物的收率，对于大部分目标产品类型，其可获得良好的结果；但对于结构更为稳定的产品，平板膜包可能可不影响产品完整性的情况下，获得更高的通量。

一次性使用在操作简便性、灵活性、节省时间以及清洗缓冲液使用等方面的优势，已经逐渐得到行业的认可，现在，生物药生产链中的绝大部分步骤均已可实现基于一次性技术的操作，对于切向流过滤，包括中空纤维和平板膜包，均有成熟的一次性使用解决方案，且结合优化的管路设计，可进一步实现封闭式的无菌操作。对于mRNA-LNP，由于脂质成分的使用，如采用重复使用方式，可能会对清洗步骤造成额外的挑战，特别是加上需要防爆或防静电设置的乙醇等溶剂的影响。当然，从生产规划角度看，经济性是一个重要考量因素，需要根据计划的生产规模，建立纳入各方面因素的经济性模型，包括膜包本身的成本、重复使用时的使用次数、清洗缓冲液成本以及储存和验证的相关影响等等，最终结果可能因生产规模、工厂条件、项目运营规划而有不同。

泵是提供“切向流”以及驱动滤液通过膜所需的跨膜压的来源。目前，有多种不同的泵形式被用于切向流过滤，包括蠕动泵、隔膜泵以及磁力离心泵等。蠕动泵通过连续挤压软管来驱动料液流动，因料液与泵无接触，所以不容造成污染；隔膜泵基于类似心脏跳动的原理，采用四柱塞隔膜技术，可通过缓慢“心跳”柔和泵送，四个隔膜的每个冲程均由连接至电机的偏心轴产生，采用该运行方式，泵可轻缓、安全、平稳泵送料液。磁力离心泵基于磁悬浮原理，泵叶轮无接触地悬浮于密封壳体内，并由电机磁场驱动，从而产生连续平稳的流量。针对不同的目标产物条件和处理规模，可根据一定的参数选择合适的泵形式和尺寸，如特定的输出流量要求以及一次性/可重复使用选择。如样品处理量极低时，可选择蠕动泵，以降低系统的最低运行体积要求；如目标产品较不稳定，即使仅蠕动泵的挤压也易受破坏时，可尝试隔膜泵或磁力离心泵。

切向流过滤的主要工艺参数包括切向流速（也称错流流速）、跨膜压（TMP）、滤液通量、剪切力等，且各个因素之间又存在相互影响。切向流速是流经膜表面的实际循环流速，是对膜表面形成冲扫作用的来源，切向流速越高，冲扫作用越强，膜污染的几率越低，但切向流也与流道内所形成的剪切力正相关，所以切向流速的选择应保持在对应的剪切力不影响产品质量的条件下，根据经验法则，可使用~3000-4000S-1剪切作为初始试验选择，并根据滤液通量和产品质量等结果进行调节。另一方面，TMP是驱动滤液形成的直接动力，其取决于进样压力以及通过过滤器的压力降等值，在一定操作范围内，TMP与滤液通量正相关，但在更高的TMP条件下，也更易形成膜污染，在超滤工艺中，有时会选择以恒定TMP进行操作，但随着浓缩等过程的进行，恒压条件不一定能获得稳定的滤液通量，所以恒流-恒定滤液通量也是一个可行的替代选择。在工艺开发阶段，所有工艺参数的记录和分析是先进切向流过滤系统的重要特征，这不仅在于分析故障而获得更出色、更可重复的工艺性能，也是后续工艺规模放大和法规审计的基础。

切向流过滤是mRNA-LNP工艺流程中的基本单元操作，选择合适的切向流过滤形式、系统配置以及工艺参数等工艺影响因素，是获得工艺成功的关键。瑞普利金提供基于不同过滤器形式（中空纤维和平板膜包）、不同泵形式（蠕动泵、隔膜泵、磁力离心泵）、不同使用策略（一次性使用和重复使用）的切向流过滤解决方案，且从规模缩小工艺开发到规模放大临床试验及商业化生产的一系列系统均具有完整的数据记录以及辅助分析功能，并可根据生产环境GMP要求进行配置，从而满足mRNA-LNP不同开发阶段的要求。

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